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蛋白质分离纯化步骤（二） 分离纯化蛋白质的一般程序 2.1 材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等，江苏样品前处理蛋白纯化系统制造厂家。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3，江苏样品前处理蛋白纯化系统制造厂家. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，江苏样品前处理蛋白纯化系统制造厂家，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。江苏样品前处理蛋白纯化系统制造厂家

    蛋白质纯化方法-亲和层析亲和层析法包括特异性配体亲和层析法以及通用性配体亲和层析法。比较这两种亲和层析法。特异性配体亲和层析法通常将复杂的生命大分子物质作为配体，它的结合力比较大河吸附选择性比较强。而通用性配体亲和层析法通常将简单的小分子物质作为配体，因此，它具有低廉的成本，吸附容量比较高，通过对吸附和脱附条件的改善能够使得层析的分辨率提高。原理亲和层析的原理类似于酶-底物，***-受体与抗原-抗体等特异性反应的机理。有一定的亲和力在每对反应物之间。与在酶与底物的反应中，只有特异的底物才可以结合一定的酶，使复合物产生相同。在亲和层析中，只有特异的配体才可以和一定的生命大分子有亲和力，并且使复合物产生。亲和层析配体呈固相，而酶与底物的反应底物呈液相是它们的不同点。事实上，亲和层析是在含有活化基团的基质M上以共价键的方式固化具有识别能力的配体L，将固相载体制作成功而固化后的配体束缚特异物质的能力依然保持。所以当在小层析柱装入固相载体，使得欲分离的样品在该柱经过。此时，样品中对配体有亲和力的物质S就能够通过结构互补效应、范德瓦尔力与静电引力等作用在固相载体上吸附着。 江苏样品前处理蛋白纯化系统制造厂家

三、蛋白质分子量的测定 蛋白质分子量测定的方法很多，目前常用的方法有以下几种。 3.1 凝胶过滤法 凝胶过滤法测定蛋白质分子量的原理如“分离纯化方法”中所 述。一定型号的凝胶颗粒上具有一定大小的孔隙，只允许较小的分子进入胶粒，而大于孔隙的分子则不能进入胶粒而被排阻在胶粒外面。用洗脱液洗脱时，被排阻的分子量大的蛋白质先被洗脱下来，随后能够进入颗粒的蛋白质也按分子量大小而先后被洗脱下来，分子量越小的越后被洗脱下来。由于不同排阻范围的葡聚糖凝胶有一特定的蛋白质分子量范围，在此范围内，分子量的对数和洗脱体积之间成线性关系。因此，用几种已知分子量的蛋白质为标准进行层析分析，以每种蛋白质的洗脱体积对它们的分子量的对数作图，绘制出标准洗脱曲线。未知蛋白质在同样的条件下进行层析分析，根据其所用的洗脱体积，从标准洗脱曲线上可求出此未知蛋白质对应的分子量来。

蛋白质分离纯化步骤（二） 2.4.3. 亲和层析 亲和层析（affinity-chromatography）分离技术是根据许多蛋白质对特定的化学基团具有专一性结合的原理。这些能被生物大分子如蛋白质所识别并与之结合的基团称为配基或配体（ligand）。亲和层析是一种极有效的分离纯化蛋白质的方法。例如酶对它的底物具有特殊的亲和力；抗原和抗体互为配基。以伴刀豆球蛋白A（concanavalin A）的分离纯化为例，由于该蛋白对葡萄糖有专一性亲和吸附，因此可把葡萄糖通过适当的化学反应共价地连接到像琼脂糖凝胶一类的载体表面上。为了防止载体表面的空间位阻影响待分离的蛋白质大分子与其配基的结合，在配基和载体之间往往插入一段所谓的连接臂（或称为间隔臂，spacerarm），使配体与载体之间保持足够的距离。 将这种多糖颗粒装入一定规格的玻璃管中就制成了一根亲和层析柱。当含有伴刀豆球蛋白的提取液加到层析柱的上部，并沿柱从上往下过时，待纯化的蛋白质与其特异性配基结合而被吸附到柱上，其他蛋白因不能与葡萄糖配基结合将通过柱子而流出（图2-28a）。然后采用一定的洗脱条件，如浓的葡萄糖溶液进行洗脱，即可把该蛋白质洗脱下来，达到与其它蛋白质分离的目的。

三、蛋白质分子量的测定 3.3 沉降法 沉降法又称超速离心法。蛋白质溶液在受到强大的离心力作用时，蛋白质分子趋于下沉，沉降速度与蛋白质分子的大小、密度和分子形状有关，也与溶剂的密度和粘度有关。蛋白质颗粒在离心场中的沉降速度用每单位时间内颗粒下沉的距离来表示。 在离心场中，蛋白质分子所受到的净离心力（离心力减去浮力）与溶剂的摩擦力平衡时，每单位离心场强度的沉降速度称为沉降系数（Sedimentation Coefficient）。国际上采用Svedberg单位作为沉降系数的单位，用S表示，以纪念超速离心法的创始人，瑞典***的蛋白质化学家T.Svedberg。一个Svedberg单位（或直接称一个S）为1×10—13s。蛋白质的沉降系数大约在1×10—13～200×10—13s范围内，即1S～200S。江苏样品前处理蛋白纯化系统制造厂家

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蛋白质分离纯化步骤 蛋白质分离纯化的一般原则： 大多数蛋白质在组织细胞中都是和核酸等生物分子结合在一起，而且每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。许多蛋白质在结构、性质上有许多相似之处，所以蛋白质的分离提纯是一项复杂的工作。到目前为止，还没有一**成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来。但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一种较合适的分离纯化程序以获得高纯度的制品。且分离的关键步骤、基本手段还是共同的。 蛋白质提纯的目的是增加产品的纯度和产量，同时又要保持和提高产品的生物活性。因此，要分离纯化某一种蛋白质，首先应选择一种含目的蛋白质较丰富的材料。其次，应设法避免蛋白质变性，以制备有活性的蛋白质。对于大多数蛋白质来说，纯化操作都是在0～4℃的低温下进行的。同时也应避免过酸、过碱的条件以及剧烈的搅拌和振荡。另外，还要设法除去变性的蛋白质和其它杂蛋白，从而达到增加纯度和提高产量的目的。江苏样品前处理蛋白纯化系统制造厂家

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