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蛋白质分离纯化步骤（二） 分离纯化蛋白质的一般程序 2.1 材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破，北京直销蛋白纯化系统制造厂家。这种方法简单方便，北京直销蛋白纯化系统制造厂家，北京直销蛋白纯化系统制造厂家，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。北京直销蛋白纯化系统制造厂家

蛋白质分离纯化步骤（二） 2.4 样品的进一步分离纯化 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。 1. 凝胶过滤层析 凝胶过滤层析（gel-filtration chromatography）又称为分子排阻层析或分子筛层析。它是将葡聚糖凝胶（Sephadex）装入一个柱子中，制成凝胶柱。这种凝胶颗粒具有网状结构，不同类型凝胶的网孔大小不同。当把蛋白质混合样品加到凝胶柱中时，比凝胶网孔小的蛋白质可进入网孔内，而大于网孔的分子则不能进入被排阻在凝胶颗粒之外。当用洗脱液洗脱时，被排阻的分子量大的蛋白质直接通过凝胶之间的缝隙先被洗脱下来，而比网孔小的蛋白质可连续不断地进入网孔内。这样的小分子不但流经的路程长，而且受到来自凝胶内部的阻力也很大，所以蛋白质越小，从柱子上洗脱下来所需时间越长。由于不同蛋白质的分子大小不同，进入网孔的程度不同，因此流出的速度不同，洗脱所用体积及时间不同，从而达到分离的目的。浙江样品前处理蛋白纯化系统***的选择

实验室及中试放大规模蛋白纯化系统 Unique Autopure系列蛋白纯化系统 主要应用领域 ： – 蛋白纯化系统主要应用于单抗、重组蛋白、疫苗、生化 药、、天然产物和多糖等生物制药领域。用于生物制品的下游工艺的分离纯化。 Unique AutoPure 系列蛋白纯化系统 ： 产品特点及优势： – 模块化设计，提供多个配置，满足特殊工艺流程需求 - 低脉动高精度双柱塞输液泵 ，保证优异的分离重现性 ; – 全系统与液体接触的地方均由生物兼容性材料组成、符合FDA、USP VI等相关法规要求 ; – DAD全谱直读检测器，避免了传统的机械切换式检测器所带来的不稳定性及高故障率 ; – 固定波长检测器灯为长寿命LED灯，寿命大于8000小时，降低维护成本 ; – **技术紫外检测器流通池，低死体积、低峰拓展，提高了色谱分离度 ; – 高灵敏度在线pH、电导率、紫外检测器，低死体积、低峰拓展，提高了色谱分离度 ; – 集中了buffer选择阀，自动进样阀、柱位阀等自动化组件，提高了纯化的自动化程度 ; – 具有柱前、柱后、压差报警，气泡传感器检测等功能，极大的保护了系统及层析柱的安全性 ; – 层析工作站软件是一款功能强大、性能先进、高稳定性的色谱数据管理系

蛋白质分离纯化步骤（二） 2.4.2 纤维素柱层析法 该法是利用蛋白质的酸碱性质作为分离的基础。离子交换纤维素（cellulose ion-exchanger）是人工合成的纤维素衍生物，它具有松散的亲水性网状结构，有较大的表面积，使蛋白质大分子可以自由通过。因此常用于蛋白质的分离。 （1）羧甲基纤维素（CM-纤维素） 在纤维素颗粒上带有羧甲基基团。在中性pH条件下，羧甲基上的质子可解离下来（图2-27a），而溶液中带正电荷的蛋白质分子可与纤维素颗粒上的羧甲基负电荷结合。可交换的基团带正电，因此是一种阳离子交换剂。蛋白质与离子交换纤维素之间结合能力的大小取决于彼此间相反电荷基团之间静电吸引。 (2）二乙氨基乙基纤维素（DEAE-纤维素） 在中性pH条件下，它含有带正电荷的基团，可与溶液中的带负电荷的蛋白质结合，可交换的基团带负电荷，因此是一种阴离子交换剂。当某一蛋白质混合溶液通过装有DEAE-纤维素的层析柱时，带正电荷的蛋白质不能结合而随着洗脱液的流动先被洗脱下来。带负电荷的蛋白质将被结合到柱上。结合力取决于彼此相反电荷基团间的静电吸引。然后选用一定pH和离子强度的缓冲液进行洗脱，改变蛋白质分子所带的静电荷，依次从层析柱流出达到相互分离的目的。

三、蛋白质分子量的测定 蛋白质分子量测定的方法很多，目前常用的方法有以下几种。 3.1 凝胶过滤法 凝胶过滤法测定蛋白质分子量的原理如“分离纯化方法”中所 述。一定型号的凝胶颗粒上具有一定大小的孔隙，只允许较小的分子进入胶粒，而大于孔隙的分子则不能进入胶粒而被排阻在胶粒外面。用洗脱液洗脱时，被排阻的分子量大的蛋白质先被洗脱下来，随后能够进入颗粒的蛋白质也按分子量大小而先后被洗脱下来，分子量越小的越后被洗脱下来。由于不同排阻范围的葡聚糖凝胶有一特定的蛋白质分子量范围，在此范围内，分子量的对数和洗脱体积之间成线性关系。因此，用几种已知分子量的蛋白质为标准进行层析分析，以每种蛋白质的洗脱体积对它们的分子量的对数作图，绘制出标准洗脱曲线。未知蛋白质在同样的条件下进行层析分析，根据其所用的洗脱体积，从标准洗脱曲线上可求出此未知蛋白质对应的分子量来。四川化学分析蛋白纯化系统制造厂家

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